Biologie Question #1543
sabiha (Genre: femelle, Àge: 25 années) de lahore, Pakistan sur 11 août 2003 demande:
Il y a une polémique parmi mes collegues qui pendant l'électrophorèse de gel d'agarose la bande qui entre en fluorescence est réellement de l'ADN mitochondrique au lieu de l'ADN genomic. L'ADN de Genomic maintient dedans bien. Ceci signifie que toutes études moléculaires sont contre l'ADN mitochondrique. Veuillez nous dépanner avec cette polémique.
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La réponse
Vous pouvez très bien avoir une combinaison de l'ADN mitochondrique et de l'ADN genomic dans votre échantillon. Cependant, vous pouvez faire un peu de la recherche dans des méthodes d'isolement pour s'assurer que votre cellule/échantillon de tissu ne contient aucune mitochondrie avant que vous isoliez l'ADN. Excepté ceci, il y a quelques manières que vous pouvez examiner votre échantillon pour l'ampleur de la contamination, et la présence même de la contamination elle-même. Une fois que vous vous rendez compte des marques mitochondriques d'ADN de contribution dans votre échantillon, vous pouvez apprendre à soustraire ceci dehors dans votre analyse.
Chaque les mitochondries contient beaucoup de copies d'un chromosome simple et circulaire d'approximativement 16 KBs. Le measley 16 KBs de code serait facilement enterré dans un plus grand échantillon genomic d'ADN. Cependant, il y a beaucoup de mitochondries dans une cellule, par rapport à seulement un noyau.
Pourquoi ne pas commencer par éliminer la possibilité de mitochondries dans votre échantillon ? Comment est-ce que votre ADN est isolée et préparée pour le chargement de gel ? Si vous homogénéisez et centrifugez vos cellules avant l'isolement d'ADN, alors la réponse est assez facilement atteinte--les mitochondries et les noyaux fractionnent à différentes vitesses centrifuges. Cependant, si vous employez le lysis alkalin, alors ce que vous granulez est probablement un peu des deux genres d'ADN. Si l'ADN est alors cisaillée, alors l'ADN mitochondrique et genomic devrait être fragemented à la même taille et plus tard courrait ensemble dans la bande. Une expérience simple serait d'isoler des manières d'ADN deux. Dans la même quantité de produit de départ, employer une méthode pour séparer l'ADN mitochondrique de l'ADN nucléaire et puis pour isoler l'ADN des deux séparément, et des autres pour isoler aléatoirement toute l'ADN. Courir les échantillons sur un gel (ADN nucléaire, ADN mitochondrique, ADN totale) côte à côte et les souiller alors. Vous aurez une idée de la taille et de la quantité relatives d'ADN mitochondrique dans un échantillon donné. (Peut-il même voir sur votre gel ? Combien intense est la bande ? Y a il quelque chose à gauche plus de dans les puits ?)
Il y a généralement beaucoup d'ADN genomic à gauche dans bien d'un gel standard si l'échantillon chargé est très concentré et/ou incorrectement réduit en fragments. L'ADN lovera dedans sur elle-même aux degrés variables, et les moindres échantillons enroulés courront « plus grand » sur le gel. Ceux-ci peuvent sembler qu'elles ne s'adaptent pas même par les pores en votre gel, de ce fait rester tellement grand derrière dans le puits. Les parties enroulées fonctionneront à travers à différentes vitesses, selon la façon dont étroitement elles sont enroulées. (Les moyens plus lovés « plus petits » et cette ADN fonctionneront plus rapidement par le gel.) changer la concentration de votre gel pourrait vous aider à laisser moins derrière dans le puits.
Si vous ne pouvez pas pratiquement changer vos méthodes d'isolement, vous pouvez devoir sonder votre échantillon d'une manière quelconque pour la présence de l'ADN mitochondrique possible. Vous pourriez considérer employer les amorces gène-spécifiques de PCR et votre échantillon d'ADN pour essayer et isoler un gène mitochondrie-spécifique. PCR en temps réel est très utile à cette fin, et il y a déjà les ensembles mieux habillés pour les gènes mitochondriques disponibles. Essayer ces deux sites Web pour plus de détails :
https://abassays.celera.com/cdsEntry/Form/taqman_search_basic.jsp
http://www.promega.com/geneticidproc/ussymp13proc/abstracts/33_biondo.pdf
Pour finir, vous pourriez considérer sonder votre échantillon d'ADN pour SNPs provenant de la mère, comme l'ADN mitochondrique est héritée par la mère seulement.
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